Hola Lizeth! Gracias por tu comentario! Es un gusto saber que el video fue de ayuda para ti! Cualquier cosa en la que pueda apoyar, no dudes en compartirla
Hola, excelente trabajo, muy didáctico. Trabajo haciendo diagnóstico molecular de Covid 19, pero tengo algunas dudas, pues soy veterinario mas no biólogo molecular. En el laboratorio se hace por supuesto amplificación del E-Gyn el N-Gyn pero usamos RNaseP (humana como control del proceso la amplificación . Esto significa que solo evaluamos solo esas 3 curvas, aparte obviamente de los controles positivos y negativos. Mi pregunta es: 1) es condición sine qua non evaluar también el Rdrp para dar como positiva una muestra de SARS Cov 2 ? ... 2) cuando hablas de "control Interno" te refieres al los controles positivos que se agregan despues de la extracion del RNA? ? ...porque nosotros usamos 2 controles que se agregan a los platos después del proceso de Lysis (antes de la extracción) . Muchisimas gracias de antemano. ;- )
Buenos días, gracias por tus comentarios. En primera instancia, el uso de los diferentes genes como ORF1a, N, RdRp, N, entre otros debe ser anclado con la estrategia que se busque, algunos genes son de tamizaje de varios coronavirus como el gen E y otros ya son específicos del SARS-CoV-2 como N (si tiene un buen diseño de primers), RdRp, entre otros. Si el kit está apropiadamente usando primers específicos para SARS-CoV-2 el uso de E y N puede ser suficiente. Por otra parte, hay dos tipos de controles que se recomiendan: los controles positivos y negativos son reactivos que permiten confirmar que tu mastermix esté bien preparado funcione apropiadamente y no esté contaminada; por otra parte el llamado Control Interno es una diana adicional que se agrega al esquema como por ejemplo: E y N + RNAsaP, siendo este último un gen del ser humano y que al estar presente te garantiza que la muestra se encuentra en buen estado, fue extraída apropiadamente y esto es información que tienes en cada paciente. Hay otros esquemas (que yo prefiero no usar a veces) ya que se utilizan Controles Exógenos que básicamente es adicionar un fago o un plásmido a tu muestra para que acompañe la extracción, pero da reactividad si es una muestra de agua, una muestra degradada o una buena muestra.
Buen video, tengo una duda había leído que una de las principales desventajas de la qPCR es que necesariamente usa ADN y siendo que los coronavirus tienen ARN de sentido positivo, como se resuelve ello para llegar hacer una qPCR.
Gracias por su comentario Alonso. Todo lo expresado en el comentario es real, por eso la estrategia para el diagnóstico de COVID y otros targets RNA utiliza un proceso previo llamado retrotranscripción, por esta razón las pruebas reciben un nombre completo de qRT-PCR. Este proceso se lleva a cabo por medio del uso de una enzima llamada transcriptasa reversa (normalmente generada por los retrovirus) que a partir de una molécula de RNA genera lo que se denomina un cDNA (complementary DNA). Una vez se genera el cDNA, el proceso de qPCR se puede realizar de manera regular Actualmente este proceso para que no implique dos pasos, se realiza por medio del uso de un modelo llamado one-step que comprende enzimas que realizan la retrotranscripción y el proceso regular en un solo paso
Hola otra vez, (no me quedo muy claro como el SYBR GREEN produce la fluorescencia , cuando dices que el quimico se intercala en la doble cadena del DNA te refieres que cuando el primer encuentra la secuencia Targe, y lo amplifica, entonce allí se intercala? como pasa de un estado inactivo a emitir fluorescencia? muy agradecida de antemano por tu ayuda.
Buenos días, gracias nuevamente por tu comentario. El SYBR GREEN es un agente intercalante, quiere decir que se une al DNA de cadena sencilla, por lo que cuando el DNA se encuentra en estado dsDNA se encuentra en su versión libre y no fluorescente. La unión del SYBR GREEN al DNA de cadena sencilla y a nucleótidos en síntesis y cuando se encuentra en su versión "binding" su configuración tridimensional le permite emitir fluorescencia. Espero que esta información sea útil Un saludo!
Muy buen video, los felicito gracias por compartir la interpretación 👏👏
Excelente video interpretativo para el Covid19. Muy agradecido
Gracias Mijali! Cualquier cosa en la que podamos ser útiles, va a ser un gusto apoyar!
Que excente video me ayudo a comprender muy bien 👍
Hola Lizeth! Gracias por tu comentario! Es un gusto saber que el video fue de ayuda para ti! Cualquier cosa en la que pueda apoyar, no dudes en compartirla
Hola, excelente trabajo, muy didáctico. Trabajo haciendo diagnóstico molecular de Covid 19, pero tengo algunas dudas, pues soy veterinario mas no biólogo molecular. En el laboratorio se hace por supuesto amplificación del E-Gyn el N-Gyn pero usamos RNaseP (humana como control del proceso la amplificación . Esto significa que solo evaluamos solo esas 3 curvas, aparte obviamente de los controles positivos y negativos. Mi pregunta es: 1) es condición sine qua non evaluar también el Rdrp para dar como positiva una muestra de SARS Cov 2 ? ... 2) cuando hablas de "control Interno" te refieres al los controles positivos que se agregan despues de la extracion del RNA? ? ...porque nosotros usamos 2 controles que se agregan a los platos después del proceso de Lysis (antes de la extracción) . Muchisimas gracias de antemano. ;- )
Buenos días, gracias por tus comentarios. En primera instancia, el uso de los diferentes genes como ORF1a, N, RdRp, N, entre otros debe ser anclado con la estrategia que se busque, algunos genes son de tamizaje de varios coronavirus como el gen E y otros ya son específicos del SARS-CoV-2 como N (si tiene un buen diseño de primers), RdRp, entre otros. Si el kit está apropiadamente usando primers específicos para SARS-CoV-2 el uso de E y N puede ser suficiente. Por otra parte, hay dos tipos de controles que se recomiendan: los controles positivos y negativos son reactivos que permiten confirmar que tu mastermix esté bien preparado funcione apropiadamente y no esté contaminada; por otra parte el llamado Control Interno es una diana adicional que se agrega al esquema como por ejemplo: E y N + RNAsaP, siendo este último un gen del ser humano y que al estar presente te garantiza que la muestra se encuentra en buen estado, fue extraída apropiadamente y esto es información que tienes en cada paciente. Hay otros esquemas (que yo prefiero no usar a veces) ya que se utilizan Controles Exógenos que básicamente es adicionar un fago o un plásmido a tu muestra para que acompañe la extracción, pero da reactividad si es una muestra de agua, una muestra degradada o una buena muestra.
Hola, Diana.
Una consulta en que caso podría generarse amplificaciones tardias del NTC a ct mayores a 35 ct en una qPCR de 40 ciclos.
Muchas gracias,
Muchísimas gracias ,me quedo muy claro , un saludo afectuosos desde CHILE
Gracias por tu comentario Marisol! Un afectuoso saludo, cualquier cosa en la que pueda ser útil, aquí estoy
Buen video, tengo una duda había leído que una de las principales desventajas de la qPCR es que necesariamente usa ADN y siendo que los coronavirus tienen ARN de sentido positivo, como se resuelve ello para llegar hacer una qPCR.
Gracias por su comentario Alonso. Todo lo expresado en el comentario es real, por eso la estrategia para el diagnóstico de COVID y otros targets RNA utiliza un proceso previo llamado retrotranscripción, por esta razón las pruebas reciben un nombre completo de qRT-PCR. Este proceso se lleva a cabo por medio del uso de una enzima llamada transcriptasa reversa (normalmente generada por los retrovirus) que a partir de una molécula de RNA genera lo que se denomina un cDNA (complementary DNA).
Una vez se genera el cDNA, el proceso de qPCR se puede realizar de manera regular
Actualmente este proceso para que no implique dos pasos, se realiza por medio del uso de un modelo llamado one-step que comprende enzimas que realizan la retrotranscripción y el proceso regular en un solo paso
Hola otra vez, (no me quedo muy claro como el SYBR GREEN produce la fluorescencia , cuando dices que el quimico se intercala en la doble cadena del DNA te refieres que cuando el primer encuentra la secuencia Targe, y lo amplifica, entonce allí se intercala? como pasa de un estado inactivo a emitir fluorescencia? muy agradecida de antemano por tu ayuda.
Buenos días, gracias nuevamente por tu comentario. El SYBR GREEN es un agente intercalante, quiere decir que se une al DNA de cadena sencilla, por lo que cuando el DNA se encuentra en estado dsDNA se encuentra en su versión libre y no fluorescente. La unión del SYBR GREEN al DNA de cadena sencilla y a nucleótidos en síntesis y cuando se encuentra en su versión "binding" su configuración tridimensional le permite emitir fluorescencia. Espero que esta información sea útil
Un saludo!
@@mantillam muchas gracias por tu tiempo, me quedo muy claro. Gracias :-)..Saludos desde Múnich /Alemania.
el audio podría mejorarse.