Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR): Basic Concepts
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- เผยแพร่เมื่อ 23 ก.ค. 2024
- This video aims to review the principle of reverse transcriptase PCR, or reverse transcription PCR (RT-PCR). Throughout it, we will review concepts such as:
* Reverse transcription or reverse transcription (00:17)
* Conventional RT-PCR or end point (02:56)
* Semiquantitative PCR (03:44)
* Absolute quantification (04:15)
* Relative quantification (05:44) - วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
El cálculo del número de copias de HIV no es 19?
De hecho, el resultado es de aproximadamente 1.43 COPIAS tras volver a hacer el cálculo. Sin embargo, mi despistada persona olvidó considerar el Ct= 5 de la potencia de la eficiencia, haciendo que el número se hiciera más grande. Otro error de mis vídeos al hacer cálculos :(
@@BrandonOrtizCasas puedes repetir la formula, porque me sale otro resultado. Gracias, excelente video!
Hola Ismael. Lo siento, pero no vi la notificación de tu respuesta. Como tal, la fórmula para la eficiencia es tal como se muestra ahí: E = 10^(-1/pendiente)
Para calcular el número de copias iniciales, podemos usar la siguiente: No = N / E^n
Donde No es el número de copias o carga inicial
N es el número calculado tras interpolar
E es la eficiencia
n = número de ciclo o Ct
Millones de gracias Brandon. Es muy gratificante encontrar canales como este dedicados a acercar a la población a la ciencia. C. Sagan estaría tremendamente feliz y orgulloso de ver este tipo de videos.
¡Muchas gracias Carlos! Agradezco bastante estas lindas palabras. Si la situación me lo llegara a permitir (la pandemia no me deja mucho tiempo libre), quisiera reanudar con los vídeos del canal. ¡Saludos!
increíble tu habilidad para explicar la biología molecular, me suscribo !
Gracias por existir bro
Realmente me convertí en tu fan, un millón de gracias contigo entendí en menos de 10 minutos todo lo que no durante el semestre. Tenga su like buen hombre
♡(*´ω｀*)/♡
¡Qué persona más agradable!
Muchas gracias
ADVERTENCIA. El audio de este vídeo NO FUNCIONA BIEN en todos los audífonos. Recomiendo ampliamente que lo escuchen a través de sus bocinas. Cambiaré el audio tan pronto YT permita hacer cambios personalizados de audio.
Es verdad que covid19 no es VIRUS?
SEGUN MENCIONAN ALGUNOS POST COVID19 ES EXOSOMAS .
Me puedes decir si es verdad que el creador de estas pruebas RT PCR mencionó no usar como diagnóstico definitivo ante alguna INFECCIÓN?
Ya que según dicen es una MANIPULACIÓN y mentira diagnósticar a una persona si tiene corona virus con estas pruebas ya que ante cualquier infección causada por enfermedades o cualquier razón DARA POSITIVO PARA CORONAVIRUS (aclarando que covid 19 según dicen nones un virus y si esa así no hay epidemia , todo seria falso?)
@@ivanleyong4025 Hasta donde puedo decirte, SARS-CoV-2 es un virus y se puede detectar con mucha eficacia usando RT qPCR. Desconozco que fuentes te mencionan eso, pero francamente no se ven muy fidedignas. Lo único que puedo verificar parcialmente es que el creador de la PCR (Kary Mullis), si tenía un escepticismo de que su prueba se usaba para diagnosticar virus que no existen. Sin embargo, ahí hay muchos detalles que no son necesariamente muy científicos...
@@ivanleyong4025 imposible que te de positivo ante cualquier infección usando como primer complementario a la secuencia del gen para la proteína N
Máximo podría detectar otro coronavirus muy muy relacionado.
Muy buena la info, lo único malo es que solo se escucha del lado izquierdo el vídeo.
Muy bueno 👌.
Una pregunta are un viaje y el país al que iré me pide RT PCR pero no sé si es la misma PCR
perfect
hola muy buen video, me gustó mucho la animación... puedo preguntarte qué programa usaste??
He variado mucho de software conforme ha pasado el tiempo. Pasé de literal usar Powerpoint, a cada vez usar más After Effects y Shotcut. Este creo que es una combinación de PPT y un poco de AE.
@@BrandonOrtizCasas muchísimas gracias!!!
Hola, buenas tardes, disculpe ser inoportuno, pero me pueden ayudar con la información de los materiales que se usan para PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
No te preocupes. Disculpa por contestar tan tarde. Para la PCR como tal, requieres prácticamente lo mismo que en una PCR normal (Polimerasa, DNTPs, buffer, primers, y/o una sonda si es en tiempo real). Pero previo a la PCR, requieres hacer la retrotranscripción, que requiere de otros materiales (otro buffer, hexámeros random, retrotranscriptasa, etc).
Solo como una pequeña corrección en los geles pusiste marcador de "peso molecular" lo cual no es así, para DNA o RNA es tamaño o talla molecular. Cuando vemos proteínas en un gel de poliacrilamida entonces si es "peso molecular" y esta dado en KDa. Saludos y excelentes videos.
Me parece que más bien, es una variación de lenguaje técnico por región (qué es más común de lo aparente). Jamás en mi vida he estado en un laboratorio donde se refieran al "peso o escalera molecular" como "tamaño o talla molecular". Incluso muchas personas lo comercializan así: www.cultek.com/marcador-de-peso-molecular-de-adn-1-10-kb-para-200-aplicaciones-2-viales-de-250-l.html
En mi país casi siempre decimos "primers", en contraste con otros países o regiones donde es más común decir "cebadores". Es un caso muy interesante a destacar, de hecho
Hola Brandon podrias hacerte un video del RACE 3'-5'
¡Claro! Pero me tomará algo de tiempo.
Excelente!
Si no es mucha indiscreción, que programa usas para hacer tu material didáctico, estudio medicina y me gustaría hacer mis presentaciones así...
Hola Ricardo! Claro que no es indiscreción. He utilizado diferentes softwares, pero per ce para animar, he utilizado desde Powerpoint (checa las opciones que te dan las animaciones) hasta After Effects. Este último es mucho más recomendado, por que las animaciones tendrán muchísima más calidad. Sin embargo, la curva de aprendizaje es mucho mayor, pero mucho más satisfactoria!
¡Saludos!
@@BrandonOrtizCasas muchísimas gracias
No sé si lo he entendido bien... ¿En todas las PCRs cuantitativas con retrotranscriptasa hay prueba con el gel de agarosa?
No. En todas las PCR cuantitativas, sea con retrotrancriptasa o no, usamos fluoresencia. En las cualitativas y semicuantitativas, SI revelamos en gel de agarosa.
Con mis audífonos lo escucho en una solo oreja xDDD
Hola, me podrías colaborar con un ejercicio con la enzima transcriptasa??
Hola Adriana. ¿Cómo te gustaría que te ayudara con esa colaboración?
Hace siglos que que dejé la biología y química en el colegio pero, qué opinas sobre las vacunas de mRNA? Crees qué haya alguna posibilidad de que de modifique el adn de nuestras celulas por la retrotransriptasa? No quiero sonar ignorante sobre las "vacunas" pero tampoco quiero ser un cordero, sólo que ya ni me acuerdo de biología básica 😔. Cuál es tu opinión amigo?
Con todo el gusto del mundo puedo contestarte eso.
Dentro de lo general y lo teórico, podría decirte a priori que las vacunas de mRNA son seguras. Sin embargo, logro entender el nivel de temor que pueden tener varias personas, al enterarse que estarían recibiendo material genético de un virus. Perdón si alargo las cosas, pero creo que si estás buscando una explicación entendible y fundamentada.
La cuestión aquí, es que yo lo veo INCREIBLEMENTE DIFÍCIL el que ese mRNA sea insertado a nuestro genoma. SI, el mRNA entra dentro de las células y aprovecha nuestra maquinaria celular para producir una PROTEÍNA.
Pero para llegar a nuestro genoma, habría demasiados problemas.
- Los humanos no tenemos retrotranscriptasas como las que tienen los virus. De hecho, una de las cosas que tiene que hacer los virus como SARS-CoV-2 es crear, entre varias cosas, retrotranscriptasas. Esas secuencias NO están dentro de las vacunas. Tenemos muy pocos complejos que cumplirían esa función (como los retrotransposones) que no tendrían ningún motivo para interactuar con ese mRNA extraño.
- Aunque de forma mágica se pudiera retrotranscribir, ¿Cómo lo meterías al núcleo? La vacuna metería el mRNA dentro de tus células, pero no necesariamente dentro del núcleo, donde está tu genoma. Para exportar mRNA normal, necesitas factores de exportación (básicamente un complejo de proteínas). Requerirías de algunos "factores de importación" que, claramente, tampoco están en la vacuna.
- Aun si los tuvieras... Necesitarías una forma de insertar de alguna forma mágica el DNA que mágicamente creamos. Nuevamente, a menos que nuestro genoma esté completamente partido a la mitad y que mágicamente entrara esta secuencia al momento de la reparación, no veo forma en la que este podría insertarse.
- Y aún si todo esto pasara por arte de magia, NO NECESARIAMENTE eso tendría un efecto realmente negativo. Si esta secuencia se inserta en una región INTRÓNICA (que... es la mayor parte de nuestro genoma) lo más probable es que no pasaría NADA. Los mismos científicos han teorizado que los intrones (búscalos por favor) son justamente secuencias que adquirimos de virus a lo largo de los miles de años.
Tendrían que pasar varias cosas extremadamente difíciles para que esto pasara. Y las vacunas hasta ahora, no han demostrado tener un efecto malo salvo para las personas alérgicas a ellas. Por lo que de momento, no les encuentro preocupación, amigo.
@@BrandonOrtizCasas noo, no es nada extensa. Me gusta leer sobre esto. Muchísimas gracias!!!🙏🙏🙏 aprecio muchísimo que te hayas tomado la molestia, es admirable. Próxima semana estudiaré un poco más sobre el tema para plantear otras dudas que tengo y probables situaciones que podrían pasar y en qué medida podrían afectar al ser humano. Trabajo fines de semama así que te estaré comentando en algunos días. Nuevamente muchas gracias!!👍
@@josepep ¡es un placer! Cuando gustes, sientete libre de hacer las preguntas que quieras!
no he llegado a entender bien la electroforesis o el paso del gel que corre las bandas, si la rt pcr retrotranscribe el arn a adn, ¿no habria que correr en el gel el adn obtenido en la rt pcr?
Es que estoy interesado en la identificación de un gen y voy a intentarlo por la técnica semicuantitativa para conociendo así la expresión del gen, saber cual es utilizando el método de sanger luego
y otra duda, en la rt pcr el arn que se está retrotranscribiendo nos dará el gen o la secuencia de adn original la cual estaba produciendo ese arn? ya que no se si depende de el tipo de arn que se retrotranscribe porque cambia la secuencia de arnm si este es primario o ya se le han quitado los intrones
Hola. No entiendo que es lo que no entiendes de la electroforesis. Efectivamente, el DNA obtenido de la reacción es el que colocas en un gel y el que haces correr. Si tu intención es identificar un gen particular, simplemente lo retrotranscribes, y con base en los primers que diseñaste, sabrás el tamaño de fragmento. Supongo que después aplicarás densitometría.
Lo que desconozco, es por que utilizarás secuenciación. ¿Qué te interesa estudiar? ¿Cambios particulares o mutaciones en el gen o transcrito, y su rol en la expresión del mismo?
Sobre tu segunda pregunta, realmente depende. ¿Qué es lo que vas a hacer o qué es lo que indican tus protocolos? Por lo que entiendo, lo ideal sería que construyeras una libreria de cDNA, donde tendrás RNA únicamente maduro, el cual separaste de todo el RNA sobrante por algún método (como utilizar un primer dT al retrotranscribir, y al hacer una separación de columnas usando oligómeros dT al momento de la extracción). Así, el RNA que consiguirás estará libre de intrones y pertenecerá únicamente a la secuencia codificante.
No se si entiendo bien esta parte, pero los PCR se utilizan para ADNvirus y los RT-PCR para ARNvirus? O estoy en un error?
Hola Eder. Técnicamente, estás en lo correcto. En una PCR convencional, puedes amplificar secuencias de cualqueir ADNvirus. Para los ARNvirus, con que pases de RNA a cDNA, puedes también amplificarlos. RT-PCR es básicamente una Retrotranscripción seguida de una PCR convencional.
@@BrandonOrtizCasas Ya entiendo, muchas gracias por contestar, de veras!!!!
Estoy estudiando este tema para un examen y después de haber visto los distintos tipos de PCR que existen, me surge una duda...
¿Este tipo de PCR concreto es el que se está realizando actualmente para las pruebas de COVID19?
Ojalá alguien pueda responderme. Un saludo y excelentes vídeos!
Este tipo de PCR (específicamente RT-PCR en tiempo real) es el utilizado para casi todas las pruebas de COVID.
@@BrandonOrtizCasas Muy interesante, gracias!!!
Es verdad que esta prueba no es recomendable para detectar covid? O solo son chismes de la gente?
En todo caso mi pregunta sería esta prueba si es confiable para detectar si alguien tiene covid19?
Espero no sonar muy ignorante, pero quisiera informarme y si tienes la respuesta por favor me digas
Hola Patricia. Muchísimas gracias por preguntar. Con mucho gusto respondo su pregunta.
La respuesta corta y simple, es que esta técnica SI es una buena herramienta para la detección de SARS-CoV-2 en pacientes.
La respuesta más elaborada, es que a pesar de que el principio de una PCR es la misma, los parámetros analíticos (osea, aquellos que te dicen que tan confiable y seleciva es) pueden variar de kit en kit, de laboratorio a laboratorio, e incluso de persona en persona (de ahí la importancia de que se utilicen kits o sistemas previamente validados, en laboratorios certificados, y por gente competente). Incluso el que exista un falso positivo o negativo puede suceder si una muestra no es tomada correctamente (puedes tener un falso negativo si no fue tomada bien del paciente, o un falso positivo si existió contaminación).
Hay otros "chismes" al respecto de la PCR de que esta no es funcional. Pero la mayoría de esos chismes tienen poco o nada que ver con los principios de la técnica, y son fácilmente refutables si tienes los conocimientos suficientes en el tema.
Si la prueba se hizo bien en todas sus partes, debería tener el suficiente poder como para darte un diagnóstico correcto.
@@BrandonOrtizCasas muchas gracias
@@PatiluAguirre que no te engañen Patricia, el propio creador de la técnica PCR y premio Nobel Kary Mullis decía que no debía usarse para diagnosticar infecciones virales, y tenía razón, porque esta técnica se basa en replicar en laboratorio el material genético que extraen de tu cuerpo, y luego contabilizan lo que ellos mismos replicaron para decirte si estas infectada o no, osea que contabilizan algo artificial que no representa la realidad de lo que tenes en tu cuerpo, asi de simple, estos fundamentalistas del dogma científico te van a decir que sirve cuando no es así, no sirve para contabilizar nada, ya que no representa nada real!.
@@PatiluAguirre es como pedirte que me des todo el dinero que traes en tu bolsillo y le pongas tu nombre, y me das un dolar, yo luego en mi casa falsifico ese billete un millón de veces y le pongo a todos tu nombre, y uso esa prueba para decir que eres millonaria, ES UNA MENTIRA!
@@veronicapaez2455 no sabéis hacer textos sin faltas de ortografía vais a saber lo que dijo el creador de la PCR o iba a saber él cómo iba a desarrollarse su técnica hasta poder ser cuantitativa.
y pensar que este video se hizo antes del COVID-19
por favorr🙏
estoy en 5to de secundaria y te entendí todo graciass
Lo que me molesta es que el vídeo es en español y mencionen DNA Y RNA, cuando es ADN Y ARN
A la larga, la biología molecular es más práctica en "spanglish"
No se escucha...!
Si escuchas con audifonos, quiza tengas un ligero problema con el estereo. Pero si se escucha relativamente bien, amigo.
Usa los dos audífonos. En el audífono derecho se escucha más bajo (y no son mis audífonos) usa sólo él izquierdo, o ambos para que logres escuchar :)
Como cuando te das cuenta que te equivocaste de carrera :v
Hasta la fecha me sigo mintiendo sobre eso :(
es el estudio del coronaviruz
ontan los papers?Xd
Hola vivi. ¡Ya los puse en la descripción!
Brandon Ortiz Casas ayy gracias men
ese audio da cáncer
Ya es momento de cambiar de audífonos, amigo...
Brandon, gracias por el video. Pero realmente el audio está mal. Por un canal se escucha perfecto por el derecho solo se escucha un eco bastante molesto.
Igual el vídeo se agradece mucho.
Saludos.
Reconozco que el audio está lejos de ser el mejor, y que tiene un problema en los canales (fue uno de los últimos vídeos que hice antes de cambiar de micrófono). Pero YT no me deja cambiar el audio salvo por canciones :/
Y el vídeo no ha presentado mayores problemas. Se escucha bien con bocinas, o con audífonos de diadema.