¿Qué es y cómo funciona la PCR?
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- เผยแพร่เมื่อ 27 ม.ค. 2021
- En este vídeo explico qué es y cómo funciona la PCR. Veremos también cuales son las aplicaciones de esta técnica y plantearé un ejemplo práctico para acabar de asentar la información comentada.
CONTENIDO DEL VÍDEO
La famosa PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa en castellano, es una técnica comúnmente usada en biología molecular para multiplicar rápidamente un fragmento específico de ADN empezando con una cantidad mínima de este. Aunque ideas similares asomaban en 1971(1), la PCR fue ideada por el bioquímico Kary Mullis en 1983, lo que le valió el premio Nobel de química una década más tarde.(2)
La importancia de esta técnica resta en que, mediante una cantidad muy pequeña de una molécula de ADN de interés, podemos conseguir millones de copias, pero ¿cómo lo hacemos? Los ingredientes básicos para preparar una reacción de PCR son: 1) el fragmento de ADN molde, que queremos amplificar; 2) desoxinucleótido-trifosfatos (dNTPs) o, dicho de otra forma, las piezas básicas de una molécula de ADN; 3) dos cebadores complementarios a las hebras del ADN molde; 4) ADN polimerasa, una enzima encargada de sintetizar moléculas de ADN a partir de dNTPs. Esta enzima tiene que ser termoestable, por eso la más comúnmente usada es la Taq polimerasa. 5) iones bivalentes, como Magnesio o Manganeso, que ayudan al trabajo de la ADN polimerasa (3).
¡Una vez conocemos los ingredientes básicos, vamos a preparar el cóctel! Una reacción de PCR consta de 25-45 ciclos. Cada ciclo consistirá en 2-3 pasos o cambios de temperatura, en este ejemplo usaremos 3 cambios de temperatura por ciclo. ¡Empecemos con el primer ciclo! A) El paso inicial consiste en la desnaturalización del ADN o, dicho de otra forma, la separación de las 2 hebras que lo componen. Este paso suele realizarse a una temperatura de 94ºC. B) El siguiente paso es la hibridación, la cual sucede a una temperatura más baja; esta temperatura dependerá de los cebadores, pero suele ser entre 45-68ºC y suele durar de 15-60 segundos. En este paso los cebadores se unirán a su secuencia complementaria del ADN molde. C) El paso final del ciclo es la elongación. En este, la ADN polimerasa sintetizará una cadena complementaria al ADN molde utilizando los dNTPs libres. La síntesis tomará como punto de inicio el cebador y trabajará en dirección 5’ - 3’. La temperatura de este paso dependerá de la ADN polimerasa usada, en el caso de la Taq polimerasa necesitaremos temperaturas de aproximadamente 68ºC.
Los pasos de desnaturalización, hibridación y elongación constituyen un ciclo. Después del último ciclo y para asegurarnos que todo el ADN ha sido amplificado, se realiza una elongación final, que dura entre 5 y 15 minutos. Una vez finalizada la reacción, esta se puede conservar por un tiempo indefinido a 4ºC (4).
Una vez conocemos como funciona la PCR, hablemos de sus aplicaciones. Esta técnica se usa rutinariamente en distintas áreas como: en investigación, en medicina con fines diagnósticos (5), en paleontología (6,7), en ciencias forenses (7). Para ilustrarlo mejor veamos un ejemplo: Imaginemos que queremos estudiar la presencia de un virus en una muestra humana. Si conocemos el genoma del virus, lo primero que debemos hacer es buscar una región que sea específica de éste y que no encontremos en el genoma humano. Una vez tenemos esta región, diseñaremos distintos cebadores para poder amplificarla. En el caso que la persona esté infectada por el virus, mediante una PCR podremos amplificar y detectar la región del ADN viral previamente seleccionada mientras que, si esta persona no se encuentra infectada, a falta de un ADN molde, no habrá amplificación de material genético.
Aunque en este vídeo hemos cubierto los conceptos básicos de la PCR, existen decenas de variaciones de esta técnica. Podemos hacer pequeñas modificaciones en el protocolo básico (8-10) o bien podemos cambiar componentes, como la polimerasa usada o la concentración de iones bivalentes (11-13); incluso es posible añadir pasos antes o después de la reacción de PCR como, por ejemplo, en caso de trabajar con ARN en vez de ADN (14). Como hemos visto, la PCR es una técnica increíblemente versátil y con infinidad de aplicaciones en distintos campos.
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Dibujo de Paleontología
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Escena del crimen
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Diagnóstico
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Virus
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****REFERENCIAS****
[1] Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG «Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases». J. Mol. Biol., 56, 1971, pàg. 341-361.
[2] www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/lecture/
[3] Joseph Sambrook & David W. Russel (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-1-936113-42-2. Chapter 7: Polymerase Chain Reaction
[4] international.neb.com/protocols/0001/01/01/taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer-m0273
[5] Cai HY, Caswell JL, Prescott JF (March 2014). "Nonculture molecular techniques for diagnosis of bacterial disease in animals: a diagnostic laboratory perspective". Veterinary Pathology. 51 (2): 341-50.
[6] James P. Noonan,Graham Coop, Sridhar Kudaravalli, Doug Smith, Johannes Krause, Joe Alessi, Feng Chen, Darren Platt, Svante Pääbo, Jonathan K. Pritchard, Edward M. Rubin «Sequencing and Analysis of Neanderthal Genomic DNA». Nature Medicine, 314, 580, 17-11-2006, pàg. 1113 - 1118.
[7] Alonso A, Martín P, Albarrán C, García P, García O, de Simón LF, et al. (January 2004). "Real-Time PCR Designs to Estimate Nuclear and Mitochondrial DNA Copy Number in Forensic and Ancient DNA Studies". Forensic Science International. 139 (2-3): 141-9.
[8] Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (2008). "Multiplex-Ready PCR: A new method for multiplexed SSR and SNP genotyping". BMC Genomics. 9: 80
[9] Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (July 1991). "'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification". Nucleic Acids Res. 19 (14): 4008
[10] Raoult, D; G Aboudharam; E Crubezy; G Larrouy; B Ludes; M Drancourt (2000-11-07). "Molecular identification by "suicide PCR" of Yersinia pestis as the agent of medieval black death". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (23): 12800-12803.
[11] Venkitaraman AR (April 1989). "Use of modified T7 DNA polymerase (sequenase version 2.0) for oligonucleotide site-directed mutagenesis". Nucleic Acids Research. 17 (8): 3314.
[12] Lawyer, F. C.; Stoffel, S.; Saiki, R. K.; Chang, S. Y.; Landre, P. A.; Abramson, R. D.; Gelfand, D. H. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity". PCR Methods and Applications. 2 (4): 275-287.
[13] Markoulatos, P; Siafakas, N; Moncany, M (2002). "Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach". Journal of clinical laboratory analysis. 16 (1): 47-51.
[14] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487-91
GRACIAS. En menos de 5 minutos de vídeo he entendido lo que no ha podido ni sabido explicar mi profesora en varias horas... Te debo una!
Muchas gracias por tu comentario!! Son procesos complejos y explicarlos de forma sencilla es complicado asi que me alegra leer que te ha sido de utilidad! :)
Grandísimo vídeo que explica de una forma sencilla y tremendamente efectiva el proceso de PCR.
Hola Enrique, muchas gracias por tu comentario y me alegro que te haya gustado! :)
Muy bueno el video, no se por que gente que se lo curra como tú no tiene más visibilidad !!!
Muchas gracias Marcos, al final estamos aquí para acercar la ciencia a quien le interesa y hacerla más amena para el publico general! :)
Mm en la elongación en la imagen el ADN Polimerasa esta sintetizado la cadena de 3' a 5' y no como dice de 5'a 3'
Hola Niki,
Si te fijas en el video las hebras de ADN son antiparalelas, es decir que las dos cadenas van en direcciones opuestas, las cadenas coloreadas en negro van de 5' a 3' (superior) y de 3' a 5' (inferior). Esta dirección se conserva cuando las dos hebras se separan, por lo tanto, la direccionalidad de la cadena sintetizada es de 5' a 3' por la ADN polimerasa. Entiendo que la orientación de las hebras originales (marcadas en negro en el video) puede generar confusión, pero es crucial tener en cuenta que las nuevas cadenas sintetizadas son antiparalelas y siguen la dirección de 5' a 3', tal como se muestra en la representación, tal vez puedas guiarte por los cebadores y por el inicio de la elongación, ambos se colocan y actúan de 5' a 3'.
Espero que esta explicación aclare tu inquietud y profundice tu comprensión sobre el proceso de PCR. Si tienes alguna otra pregunta o comentario, no dudes en compartirlo.
Un saludo!
👍
Muy buen video 👌
Muchas gracias, me alegro que te haya gustado!!
Donde editaste tu video?
La edición en sí es en after effects y la ilustraciones están hechas con illustrator. El montado final del video, donde añado la música y los efectos de sonido, se realiza en Premier. Muchas gracias, me alegro que te haya gustado y un saludo!