Parabéns pela excelente aula professor!! Trabalho com essa técnica a algum tempo, e uma dúvida dos integrantes de minha banca de qualificação é: como o primer se anela a fita de DNA em sua forma intacta, a grosso modo me perguntaram como o primer abre a fita de DNA para se anelar, os integrantes não concordaram com a hipótese de que o primer poderia se ligar a parte externa da fita, poderia me ajudar com isso? Grata!!!
Tinha ficado com a mesma dúvida que você! Uma coisa que eu pensei é que como a bst polimerase tem uma função de deslocamento (se assemelhando a uma helicase), talvez ela utilize o próprio dsDNA como um grande "primer", já que polimerases buscam dna pareado (ds strand), causando a reação de deslocamento de uma das fitas moldes ao realizar a síntese de uma nova fita complementar. Aí talvez essa fita molde simples permita o pareamento dos primers devidos.
Olá @Nara Teixeira! Pense que o DNA não desnatura de maneira abrupta. Essa modificação ocorre de maneira gradual com o aumento da temperatura. Ou seja, não é que quando estamos a 93°C toda fita é dupla e a 94° toda fita é desnaturada. Assim, quando a temperatura fica ao redor de 65°C você já tem uma inconstância na fita dupla de DNA que permite a "invasão" de alguns primers de maneira instável (o primer invade um trecho dupla fita, anela, desanela...). E é "nesse equilíbrio dinâmico" que a Bst consegue encontrar a ponta 3' OH. Depois disso ela não precisa que a fita esteja desnaturada, pois ela própria consegue deslocar o DNA!
@@adamoski Obrigada, não tinha pensado que na temperatura de 65°C já tinha equilíbrio de desanelamento. Dúvida: LAMP portanto, não podem ter temperaturas "baixas" (p.e. 40°C)? Pode haver um passo inicial de desanelamento (um banho de 95°C, p. ex)? Obrigada pelo vídeo.
Seria interessante um vídeo com essa técnica sendo aplicada na prática. Também fiquei em dúvida quanto a extração do dna/rna, é igual ao para pcr convencional?
Olá! O vídeo da prática talvez demore um pouco mais, não tenho acesso a todos os reagentes atualmente. Mas a extração é exatamente a mesma! E ela também funciona em estratégias diretas, sem a necessidade de extração, desde que com algumas otimizações.
Olá Julia! Existem algumas revisões disponíveis sobre o tema, mas só em inglês. Uma boa e recente é: www.sciencedirect.com/science/article/pii/S266605392030014X
Vai depender muito do conjunto. Pensando na reação em si, é 30 minutos ou menos. Mas é necessário preparar a amostra, o que pode levar entre 15 minutos e 2 horas.
Aula excelente! Impossível ser mais didático! Parabéns!
Melhor professor que já tive
Muito obrigada por esse vídeo!!!!!! Parabéns pela didática e o seu conhecimento na área!!! Sensacional.
Muito bom! Eu trabalho com RT-PCR e tava muito curioso em entender o RT-LAMP
Muito bom, aprendi bastante. Obrigada por compartilhar seus conhecimentos conosco. Bem didático também!
Aula excelente, me ajudou muito a compreender a técnica, estava precisando. Parabéns!
Excelente explicação! Iremos implementar esta técnica na Federal do Amazonas
Oi Nathália. Gostaria de falar com você sobre essa pesquisa na UFAM. instagram (diegorayan)
Lindo
Parabéns, ótimo vídeo! Me salvou para aprender a técnica e apresentar o artigo da nature com aplicação no SARS-COV-2!
Muito bom!! Finalmente entendi essa técnica. Muito obrigada! Você explica extremamente bem :)
Ótimo Vídeo! Muito didático e explicação clara!
Maravilhoso
😀
Muitíssimo obrigada pelo trabalho nesse vídeo, está sendo muito útil
Agora sim consegui entender!! Ótima aula!
Muito boa a apresentação!
Parabéns. Que aula incrível!
Muy buena presentación!!!, Gracias!
Obrigada! Me esclareceu muito!
ótima explicação e apresentação!
Parabéns pela excelente aula professor!! Trabalho com essa técnica a algum tempo, e uma dúvida dos integrantes de minha banca de qualificação é: como o primer se anela a fita de DNA em sua forma intacta, a grosso modo me perguntaram como o primer abre a fita de DNA para se anelar, os integrantes não concordaram com a hipótese de que o primer poderia se ligar a parte externa da fita, poderia me ajudar com isso?
Grata!!!
Tinha ficado com a mesma dúvida que você!
Uma coisa que eu pensei é que como a bst polimerase tem uma função de deslocamento (se assemelhando a uma helicase), talvez ela utilize o próprio dsDNA como um grande "primer", já que polimerases buscam dna pareado (ds strand), causando a reação de deslocamento de uma das fitas moldes ao realizar a síntese de uma nova fita complementar. Aí talvez essa fita molde simples permita o pareamento dos primers devidos.
Olá @Nara Teixeira! Pense que o DNA não desnatura de maneira abrupta. Essa modificação ocorre de maneira gradual com o aumento da temperatura. Ou seja, não é que quando estamos a 93°C toda fita é dupla e a 94° toda fita é desnaturada.
Assim, quando a temperatura fica ao redor de 65°C você já tem uma inconstância na fita dupla de DNA que permite a "invasão" de alguns primers de maneira instável (o primer invade um trecho dupla fita, anela, desanela...). E é "nesse equilíbrio dinâmico" que a Bst consegue encontrar a ponta 3' OH. Depois disso ela não precisa que a fita esteja desnaturada, pois ela própria consegue deslocar o DNA!
@@adamoski Obrigada, não tinha pensado que na temperatura de 65°C já tinha equilíbrio de desanelamento. Dúvida: LAMP portanto, não podem ter temperaturas "baixas" (p.e. 40°C)? Pode haver um passo inicial de desanelamento (um banho de 95°C, p. ex)? Obrigada pelo vídeo.
Ótimo, Douglas. Obrigado.
Seria interessante um vídeo com essa técnica sendo aplicada na prática. Também fiquei em dúvida quanto a extração do dna/rna, é igual ao para pcr convencional?
Olá!
O vídeo da prática talvez demore um pouco mais, não tenho acesso a todos os reagentes atualmente.
Mas a extração é exatamente a mesma! E ela também funciona em estratégias diretas, sem a necessidade de extração, desde que com algumas otimizações.
Pcr Lamp ,quais paises eurpous aceitam?
Excelente aula! Você poderia recomendar alguma bibliografia para aprender mais sobre essa técnica? Muito obrigado!
Olá Julia!
Existem algumas revisões disponíveis sobre o tema, mas só em inglês. Uma boa e recente é: www.sciencedirect.com/science/article/pii/S266605392030014X
quanto demora por medicao?
Vai depender muito do conjunto. Pensando na reação em si, é 30 minutos ou menos. Mas é necessário preparar a amostra, o que pode levar entre 15 minutos e 2 horas.
Serve apenas pro Covid-19???
Não! Podem ser desenhados primers para todos os tipos de alvos