วีดีโอ

Для демонстрации апертурной плоскости - да, распечатан фиксатор для телефона, а из бинокулярной насадки вынут окуляр, чтобы камера снимала апертурную плоскость. На мониторе - картинка полевой плоскости (препарат), на телефоне (или в верхнем левом углу видео) картинка апертурной плоскости.

День добрый! К сожалению, многие изображения для курса были взяты из разных источников в интернете, только небольшое количество изображений моего авторства, поэтому могу выложить только те, которые были свободно доступны или сняты мной. Потом надеюсь проставить ссылки на исходные сайты откуда изображения были взяты. Ссылка на папку с картинками и заданиями disk.yandex.ru/d/OsvPV3klDKpuoQ .

@@PavelZykin большое спасибо!

День добрый. Да, в этой вкладке указан размер одного пикселя в тех единицах, в которых откалибровано изображение. Если нужно получить обратное значение (количество пикселей в единице измерения) нужно разделить единицу на указанное в свойствах значение.

@@PavelZykin спасибо. Но вот вопрос, вот я хочу перевести из пикселей в мкм, какой коэффициент туда писать? Или лучше делать так как вы говорили в видео с линейкой?

@@ilyasyusin8085 День добрый! Тогда только через съёмку линейки, т.к. если считать теоретически (увеличение объёктива * увеличение насадки и учесть размер точки камеры) может быть достаточно большая ошибка.

Не понимать! Масло испаряется и оседает на линзах или вы имеете в виду что ошибка неизбежна и объектив окажется погруженным в масло?

А если вытирать?

Вы пока напальчник будете надевать, почти гарантированно испачкаете объектив. Испачкать маслом на препарате другие объективы проблематично, т.к. они короче и до препарата не достают, если специально к этому не стремиться. Но если и испачкаете, вытрите и ничего страшного. Ничего они не умрут.

Потом резина разбухнет от масла , прилипнет к линзе, а потом засохнет. Вот будет весело!!!!

Спасибо за совет.

Есть много вариантов, в том числе очень простых, из подручных материалов, например, th-cam.com/video/MgogwcXUIoc/w-d-xo.html . Более удачный вариант с двумя объективами www.cloudynights.com/topic/751583-my-3d-printed-diy-spectrograph/ .

Положение коррекционного кольца меняет силу отрицательной сферической аберрации объектива для компенсации положительной сферической аберрации, возникающей при неправильной толщине покровного стекла (для безиммерсионных объективов) или при несовпадении индексов преломления иммерсионной среды и среды, в которую заключён препарат. В редких случаях, возможна корректировка для компенсации сферической аберрации, возникающей при разных температурах (изменения коэфф преломления масла и положения линз в объективе при изменении температуры ). Т.е. кольцо может быть обозначено как толщина стекла, коэфф. преломления иммерсии или температуры, но идея та же - компенсация сферической аберрации возникающей на препарате. Кольца встречаются только на высокоапертурных (NA>0.4) объективах. Настройка для широкопольного микроскопа: 1. Сфокусируйтесь на том месте препарата, которое планируете исследовать. 2. Поворачивая корр.кольцо добейтесь наиболее чёткого изображения 3. повторно поправьте фокус. 4. при необходимости повторно подстройте кольцо. В случае конфокального микроскопа с возможностью быстрого сканирования по глубине поставьте сканирование XZ или YZ, если на препарате есть мелкие объекты, подстройте корр. кольцо так, чтобы по оси Z было наилучшее разрешение и наибольший сигнал. Есть хорошая демонстрация настройки здесь: www.microscopyu.com/tutorials/adjustment-of-objective-correction-collars . Ещё важно замечание - кольцо на корпусе объектива может быть и для других целей - непример, может быть внутренняя апертурная диафрагма для использования высокоапертурного объектива с методом тёмного поля и другая экзотика.

@@PavelZykin на olimpus uplansapo x40 не подскажете для каких целей, вроде подстройка под толщину стекла, но один человек написал, что там кольцо темного поля?

@@PavelZykin за ответ, большое спасибо - очень интересно!

@@borisgrejcha7263 Olympus UPLSAPO40XS x40 ? Если есть возможность - посмотрите, какой там артикул указан - N4274100 ? Если этот, то это подстройка на толщину покровного стекла www.olympus-lifescience.com/en/objectives/detail/0-DIRECTORY%3A%3ADirFrontend-itemId.511706523.html. Если другой - нужно смотреть на сайте www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/

@@PavelZykin Olympus UPLSAPO40X на этом сайте уже нет такой модели, там только XS осталась с силиконовой иммерсией, но это вообще бомба обьектив, прайс на него, то что я видел от 6000$

День добрый, Сергей! К сожалению конкретное ПО для клиники со ссылкой привести не могу. В клинике сейчас редко применяют микроскопический анализ для данных показателей, чаще используется проточный гематологический анализатор, например, www.sysmex-europe.com/products/products-detail/xn-1000.html . Думаю, что есть специализированное ПО, вроде был модуль для ПО Морфотест, однако не уверен, что такое ПО имеет необходимые разрешения для клиники. Для научных задач можно попробовать сделать простой обсчёт самим, с использованием ImageJ/Fiji hal.archives-ouvertes.fr/hal-01654006/document .

@@PavelZykin Спасибо большое!

Зависит от того, какой формат файлов - если медицина - наверное, DICOM ? Попробуйте открыть в FiJi. Если она открывает, то можно открыть все изображения из папки сразу в стек а затем сохранить стек как отдельные картинки или написать простой скрипт, пример которого есть в одной из следующих лекций.

@@PavelZykin ,да медицина FiJi это прога или что ? я в этом не шарю

@@mistik9575 Да, это программа обработки изображений, используемая в этом курсе. Её сайт fiji.sc/ .

Мовиол, к сожалению, густеющая среда и для моего применения не очень подходит. Во-первых вскрыть препарат без повреждения для отмывки в SDS/b-mecrcapto для перекраски другими антителами уже сложно, во вторых, когда он твердеет коэффициент преломления меняется - на краю стекла и на центре приходится коррекционное кольцо на объективе крутить - панораму всего препарата за один проход уже нормально не снять. Глицерин же везде есть, не густеет, всегда можно вскрыть лак и перекрасить препарат.

Пузырьки, обычно, в полых органах, например кишка или если говорить про растения то в листьях/семенах. Со шприцом этот воздух можно удалить.

@@PavelZykin ясно, я имел ввиду снаружи от ткани, если не прогреть агар-агар до кипения то они остаются по всей площади иногда

Спасибо, это ценно! Пока такие не пробовал - есть ли какая-то марка / ссылка на те лезвия, которые у Вас хорошо работают? Заранее спасибо!

@@PavelZykin я использовал самые разные, от SK-5 за 30 р упаковку (10 лезвий) до дорогих Stanley 1991, разницы никакой, в Леруа-Мерлен они всегда есть. Просто вбиваете в поиск трапецеидальные лезвия и смотрите по наличию

Спасибо за обратную связь! 1. Согласен, но зависит от целей. Студентов на летней практике мучаем 60-120 мкм срезами. Я режу около 90 мкм т.к. толще иммунка уже нормально не получается - середина среза для наших задач прокрашивается плохо. Когда на курс приходят медики, привыкшие резать "ленточками" парафиновые плоки - для них это недостаток. 2. Согласен. 3. У нас, в основном имунка на цитоскелетные белки или на кальций-связывающие белки. Т.к. покрашено всё оцень густо, то на широкопольном флуоресцентном даже с деконволюцией не очень удобно. 6. Покрытие, чтобы срезы от стекла не отклеивались при проводке, если это на стёклах, а не на свободно плавающих срезах. 7. Тут полностью согласен, но на практиках с вибратомом у студентов больше времени уходит на то, чтобы сделать серию срезов, чем на обычном микротоме и криостате. 8. Полосы у меня начинаются с 120 мкм и тоньше. Столик на магните - сильнее зафиксировать не получится. Держатель на Лейках хорошо прижимается винтом, так что тоже врядли. Я думаю из-за деформации лезвий или грязи/смазки на них, т.к. выраженность зависит от того, кто производитель лезвий.

@@PavelZykin с иммуноцитохимией да, там вибратомные срезы толстоваты все же. Если мембранными трейсерами типа DiI окрашивать то на 150мкм флуоресценцию отлично видно, лучше чем на 80мкм, это уже слишком тонко и картина не выигрывает при сравнении со 150мкм. Образец может быть зафиксирован неплотно клеем, и тогда пойдут и полосы, и срезы через раз. Еще как вариант (гораздо чаще) если образец в агаровом блоке слегка гуляет из-за пустот, возникших при застывании агара (бывает такой эффект) , это становится ясно только во время резки. В этом случае надо сразу образец доставать и перезаливать, что бы сидел плотно.

Спасибо за комментарий. Сразу поправлю год и журнал оригинальной статьи: HOFFMAN, R., GROSS, L. The modulation contrast microscope. Nature 254, 586-588 (1975). doi.org/10.1038/254586a0 в ней не использовался поляризатор. В статье 1977 года используются поляризатор под конденсором и анализатор на средней полоске для возможности регулировать выраженность этого эффекта для объектов с разной степенью выраженности градиентов преломляющей способности. Однако, для большинства биологических объектов 12-15% пропускания это оптимальный режим, тем не менее, согласен, не для всех. В современных микроскопах, например в инвертированных Leica DM ILM, также не используется поляризатор. Про необходимость того, чтобы щель и полоска совпадала в лекции говорится и очевидно, что для разных числовых апертур и увеличений они должны различаться (по аналогии с ранее рассмотренным фазовым контрастом). Подробнее о настройке Хоффмановского контраста есть в видео практических занятий. По поводу простоты - в 2005 году я делал его для старого МБИ-10 и всё получилось, поэтому и говорю что это можно сделать. Мластинка-модулятор была из круглого покровного стекла и напылялась в 2 захода платиной в напылялке для СЭМ, толщину слоя сейчас не вспомню, но можно подобрать. Делался вариант со смещённым модулятором, размер полос от края (диаметр стекла 8мм) был 1.2/1/5.8 мм. Про щелевую апертуру это легко посчитать или просто подобрать т.к. была вырезана из упаковки под фотобумаги. Т.к. лекция для биологов, то рассказывать более подробно про техническую часть я не стал.

@@PavelZykin Большое спасибо за ответ! да, самая первая статья идет за 1975 год, в статье 1977 года более подробно изложен уже отработанный механизм. Вы не могли бы пожалуйста чуть более подробно описать как именно вы делали Хоффмановский контраст, сейчас эта тема обсуждается на ветке www.forum.shvedun.ru/viewtopic.php?f=6&t=11009 я думаю было бы очень интересно всей заинтересованной аудитории узнать конкретные детали, а особенно мне! Спасибо)

@@АлексейЛк-ш4й Самое сложно было найти объектив, в котором есть возможность поставить что-то в апертурную плоскость. У меня была лишняя фазово-контрастная 40х, я снял заднее кольцо и там оказалась фазовая пластинка, в виде тонкого круглого стекла вроде покровного. Некоторое время потратил пока нашёл круглые покровные стёкла такого нестандартного диаметра. Далее я договорился с лаботаторией, где была напылялка для сканирующего электронного микроскопа. Мы подобрали толщину слоя, чтобы пропускание было порядка 15%. положили на наше круглое стёклышко обычное прямоугольное стекло, чтобы от края было не закрыто 2.2 мм, напылыли платину до 15% пропускания, сдвинули стекло, чтобы оно не закрывало 1.2 мм и напылыли в 5 раз больше по толщине. Получили стекло с 3 зонами - 100%, 15%, ~0%. Собрали с ним объектив, раскурочили ненужный светофильтр, который можно ставить в конденсор на место круглой апертуры для фазы, вынули окуляр, чтобы было видно апертурную плоскость. Чёрным фломастером на стекле светофильтра поставили точки так, чтобы совпадали со средней полоской, вырезали из чёрной фотобумаги круг и под эти точки срезали полоску. Недостатки моего дизайна - модулятор получается зеркальным - иногда от него виден блик, нет регулировки выраженности контраста, т.к. средняя полоска просто полупрозрачное зеркало.

@@PavelZykin спасибо за ответ! если вы не против я процитирую вас на ветке? Мне надо осмыслить эту информацию. Еще вопрос - как искать заднюю фокальную плоскость любого объектива, есть ли какие то общие правила, позволяющие сделать это на практике?

@@АлексейЛк-ш4й Да, конечно, цитируйте. Про апертурную плоскость, если не вдаваться в теорию - в правильно настроенном микроскопе в ней будет изображение краёв прикрытой _апертурной_ диафрагмы и, если свет от лампы - нити накаливания лампы. Если в объективе есть собственная диафрагма или фазовое кольцо - они как раз установлены в этой плоскости. Увидеть эту плоскость можно либо вынув окуляр, либо поставив специальный теле-окуляр, а у некоторых микроскопов на бинокулярной насадке может быть установлена линза Бертранда, которая позволяет увидеть эту плоскость не вынимая окуляра. Любой объект в апертурной плоскости будет софокусен (чётко виден) с вынутым окуляром и полностью расфокусирован (не виден) в плоскости препарата. По поводу устранения недостатков моего дизайна - у Лейки модулятор сделан из 2х пластинок одна - поляризатор, вторая чернёный металл, чтобы не было блика th-cam.com/video/jMOsoctCXxY/w-d-xo.html возможно если делать сейчас я бы попробовал так.

Относительно лекций по пробоподготовке, к сожалению, при съёмке не сработал автофокус - качество достаточное плохое, поэтому не стал выкладывать. В октябре будут следующие практики, смогу переснять эту часть и выложить отдельно.

@@PavelZykin Спасибо!

Честно говоря, конкретно с этим микроскопом не работал, но можно предположить что либо не поставлен правильный конденсор от фазово-контрастного набора (с двумя "рожками" если микроскоп от ЛОМО) или на этом конденсоре не повёрнут револьвер колец в правильное положение (чтобы кольцо соответствовало объективу). На рисунке с сайта, который удалось найти это номер "9" scopica.ru/proj/ustroystvo-dlya-nablyudeniya-metodom-fazovogo-kontrasta-i-temnogo-polya-fatek-m6-7/

@@PavelZykin Спасибо Вам, за ответ! Вроде все установлено правильно, но почему-то нахожу только темное кольцо, через центрировочный телескоп.

​@@luidmilaalekseeva7576 На всякий случай хотел уточнить - на конденсоре поясок переключения фазовых колец в каком положении стоит - "0", "D", "10", "40" или "100" ? Для фазового контраста он должен стоять в положении "10", "40" или "100", в зависимости от объектива. Если поясок пальцами не двигается, то нужно выдвинуть до упора оба коррекционных барашка ("рожки" на конденсоре) и после этого он должен свободно вращаться. Если и это не поможет - посмотреть есть ли в конденсоре эти кольца (вынуть конденсор и посмотреть снизу, через нижнюю линзу - это колечко должно быть видно).

@@PavelZykin Добрый день! Посмотрю внизу конденсатора, может на самом деле не стоят линзы. Думала, может до начала работы по настройке фаз - контр. совмещения, нужно настроить освещение по Кёллеру (только не знаю с оставленным фаз.-конт. устройством или с изначальным устройством микроскопа)?

@@luidmilaalekseeva7576 Настройка по Кёллеру необходима с фаз.-конт. устройством. Для удобства его можно перевести в положение "0", провести настройку и вернойть в положение соответствующего фазового колца (10, 40 или 100).

Если необходимо освоить криотом, то никакая книга не заменит практического общения с прибором. В СПбГУ проводятся дополнительные образовательные программы, например, по гистотехнике, где есть практические занятия biomed.spbu.ru/training/course-dop/ . По поводу литературы можно посоветовать седьмую главу из Банкрофта : books.google.ru/books/about/Bancroft_s_Theory_and_Practice_of_Histol.html?id=FoOn7il3yqcC&redir_esc=y и www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/the-art-of-embedding-tissue-for-frozen-section/ . Также есть много дополнительных техник замораживания и резки, например, по Питерсу или для сложных образцов по Кавамото.

@@PavelZykin спасибо!

Добавил ссылки на оборудование и ПО, которые упоминались в этой практике.

Маргарита, спасибо что заметили ошибку!!! Я ошибся при устном счёте, причём 2 раза :( . Для разрешения по xy в конфокальном микроскопе при размере пин-хола в 1 диск Айри мы можем посчитать диаметр одной "оптической" точки по формуле d~= (0.64 * длина волны возбуждения) / числовую апертуру. В нашем случае d~= (0.64 * 520) / 1.4 ~= 238 нм = 0.238 мкм. Дано, что поле зрения при текущей настройке микроскопа 330 мкм. Мы можем посчитать сколько таких "оптических" точек может уместиться на это поле зрения, поделив 330/0.238 = 1387 (здесь я и ошибся, не 1150). Дальше, чтобы не потерять разрешение при сканировании, нужно сканировать в 2 раза большим количеством точек - 1387 * 2 = 2774 . Так что буду исправлять на слайде для следующего года.

@@PavelZykin да, у меня так и вышло, когда считала! Спасибо, а то я начала переживать, что ничего не понимаю)